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ctab法提取dna流程图_CTAB法原理(植物DNA提取经典方法)

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原理:CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵),是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物,只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提,去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。


注:CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出,因此,在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热,且离心时温度不要低于15℃。


一、CTAB提取缓冲液的经典配方:


Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏;


EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性;


NaCl 提供一个高盐环境,使DNP充分溶解,存在于液相中;


CTAB溶解细胞膜,并结合核酸,使核酸便于分离;


β-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除。


二、CTAB提取缓冲液的改进配方:


(1) PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物,能与多酚形成一种不溶的络合物质,有效去除多酚,减少DNA中酚的污染;同时它也能和多糖结合,有效去除多糖;


(2) 蛋白质的去除:酚/氯仿抽提使用变性剂变性(SDS、异硫氰酸胍等)高盐洗涤蛋白酶处理核酸分离,纯化;


(3)多糖的去除:高盐法:用乙醇沉淀时,在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl,高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积),氯苯可以与多糖的羟基作用,从而去除多糖。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA:在500 μL DNA液中加入200μl 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl),冰浴20min.核酸分离,纯化;


(4) 多酚的去除:在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂:β-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂:如PVP(聚乙烯吡咯酮),PEG(聚乙二醇),它们与酚类有较强的亲和力,可防止酚类与DNA的结合;


(5) 盐离子的去除:70%的乙醇洗涤核酸吸附,沉淀和溶解使用合适的吸附材料吸附核酸,其它的杂质均被洗掉,达到纯化DNA的目的另一种方式加入1/10体积的NaAc(pH5.2,3M),用预冷的乙醇或异丙醇沉淀RNA吸附或沉淀后应用70%的乙醇洗涤,以除去盐离子等若长期储存建议使用TE缓冲液溶解TE中的EDTA能螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNasepH值为8.0,可防止DNA发生酸解。


三、基因组DNA提取常见问题


DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质。DNA在溶解前,有酒精残留,酒精抑制后续酶解反应,DNA中残留有金属离子,有RNA的存留。对策:重新纯化DNA,去除蛋白、多糖、多酚等杂质,重新沉淀DNA,让酒精充分挥发,增加70%乙醇洗涤的次数(2-3次),加入RNase降解RNA。


(1)DNA样品不纯,抑制后续酶解和PCR反应。DNA提取常见问题:材料不新鲜或反复冻融、未很好抑制内源核酸酶的活性、提取过程操作过于剧烈,DNA被机械打断,外源核酸酶污染反复冻融。尽量取新鲜材料,低温保存材料避免反复冻融,液氮研磨或匀浆组织后,应在解冻前加入裂解缓冲液。在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时,可增加裂解液中螯合剂的含量,细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔。所有试剂用无菌水配制,耗材经高温灭菌。将DNA分装保存于缓冲液中,避免反复冻融。


(2)DNA降解,DNA提取常见问题。实验材料不佳或量少,破壁或裂解不充分,吸附或沉淀不完全,洗涤时DNA丢失。尽量选用新鲜(幼嫩)的材料,动植物要匀浆研磨充分;G+菌,酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁。高温裂解时,时间适当延长(对于动物细胞,细菌可增加PK的用量)。增加吸附的时间、或低温沉淀小心操作。(责任编辑:大汉昆仑王)



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